Антибактериальные вещества, продуцируемые бактериями рода Bacillus

Перспективным направлением  в конструировании и совершенствовании пробиотиков является применение бактерий рода Bacillus. Эти микроорганизмы широко распространены в природе, являются устойчивыми к литическим и пищеварительным ферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в желудочно-кишечном   тракте животных. 

Среди различных представителей экзогенной микрофлоры, бациллы характеризуются рядом преимуществ, которые позволяют считать их наиболее эффективными в качестве основы новых пробиотиков. Эти бактерии (кроме B.anthracis и B.cereus), как правило, являются безвредными для организма животных даже в высоких концентрациях; обладают антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов; характеризуются высокой ферментативной активностью, что может обусловить существенное регулирование и стимулирование пищеварения; способны оказывать противоаллергенное и антитоксическое действие;  технологичны в производстве и стабильны при хранении.

Важная особенность бацилл состоит в том, что хорошо изучена их генетика и поэтому они являются перспективной системой для клонирования чужеродных генов.

В настоящее время методами генетической инженерии на основе аэробных спорообразующих   бактерий   получены   суперпродуценты различных биологически активных веществ (колицин Е2 и др). Это открывает перспективу конструирования на основе бацилл штаммов с заданными свойствами и  использования их новых свойств.

В 90-х годах прошлого века в медицинской практике проводились широкие испытания препарата, созданного сотрудниками института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, на основе штаммов  B.subtilis  ВКПМ № 2335 и B.licheniformis  ВКПМ № 2336.

Было установлено, что этот препарат более эффективен по сравнению не только с пробиотиками из представителей нормального микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (типа бифидумбактерина, лактобактерина или колибактерина), но и в сравнении с препаратами на основе монопрописей спорообразующих бактерий (бактисубтил, споробактерин).

Количество известных антибиотиков, продуцируемых спорообразующими аэробными бактериями, в настоящее время приближается к 200. По количеству продуцируемых антибиотических веществ микроорганизмы рода Bacillus уступают лишь актиномицетам.

В доступной литературе описано более 70 различных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus. Некоторые из них уже широко применяются в медицине, ветеринарии, сельском хозяй­стве, пищевой промышленности и др. Это полимиксины, колистин, бацитрацин, тиротрициновый комплекс (линейный грамицидин + тироцидин), грамицидин С, субтилин, эдеин, бутирозин.

Большинство идентифицированных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus – пептиды, вместе с тем, в последние годы все больше сообщений свидетельствуют о том, что представители данной группы микроорганизмов продуцируют антибиотические вещества, относящиеся и к другим классам соединений.

Антибиотики, продуцируемые B.subtilis  (Таблица 1)

Год открытия	Антибиотик
1911	Трипанотоксин
1944	Субтилин
1945	Субтилизин
1946	Эндосубтилизин, Бациллин
1947	Бацилломицин
1948	Субтенолин
1949	Ризос тонна-фактор, Микосубтилин, Аспергиллюс-фактор, Бацилизин, Бацилипин
1950	Итурин
1951	Обутин, Ксантелин, Бацилломиксин
1952	Флювомииин, Ризобацидин, Фунгоцин, Токсимицин, Глобицин
1955	Датемицин
1956	Антибиотик В-456
1958	Микобациллин, Петрин
1964	Антибиотик   49-4
1965	Полихлорсубтилин
1969	Субспорин
1975	Антибиотик 61-26, Антибиотик TL-119
1978	Антибиотик 26а
1979	Антибиотик   3, Полимиксин, Колистин, Бацитрацин, Тироцидин, Грамицидин С, Эдеин, Бутирозин

Образование антибиотиков происходит обычно в логарифми­ческой фазе роста для многих продуцентов, однако для спорообразующих бактерий свойственны и другие сроки их продукции.

Образование пептидных антибиотиков у бацилл контролируется азотной и углеродной репрессией; вли­яние репрессии на эти процессы может изменять взаимосвязь между характером роста культур и количеством образуемых антибиотиков.

Снижение синтеза антибиотика бациллами обуслов­лено не катаболитной репрессией углеродом, а изменением рН среды, вызванным микробным метаболизмом. Этот вывод базировался на обратном эффекте, наблюдаемом при добавлении в питательную среду CaCO₃. В дальнейшем установлено, что подавление синтеза антибиотика определяется не изменением pH среды, а образованием из глюкозы органических кислот (уксусной и пировоградной). Их нейтрализация снимает ингибирование синтеза антибиотиков.

Таким образом, пептидные антибиотики синтезируются бациллами-продуцентами в стадии активного роста. Расшифровка механизмов продукции антибиотиков способствует прогрессу исследований, связанных с внеклеточным синтезом пептид­ных антибиотиков. Внеклеточный синтез грамицидина, тироцидина, грамицидина линейного, эдеина, бацитрацина, колистина и микобациллина детально освещен в работах ученых в 70-х годах 20 века.

Биосинтетические системы бацилл, в которых происходит образование на­званных выше полипептидных антибиотиков, отличаются от систем, в которых синтезируется белок. Необходимые условия для синтеза антибиотика включают, как правило, следующие компоненты: амино­кислоты, аденозин-5-трифосфат, ионы магния, редуцирующий агент и свободную от клеток надосадочную жидкость - центрифугат культуральной жидкости.

Синтезируемые бактериями рода Bacillus антибиотики подразделя­ются на  следующие классы:

- основные пептиды (например, эдеин), подавляющие образование 30 S-рибосомальных комплексов и ингибирующие синтез ДНК;

- циклические олигопептиды (например, бацитрацин), подавляющие синтез клеточных стенок;

- линейные или циклические олигопептиды, нарушающие функции мембран - грамицидин, тироцидин В или ингибирующие синтез РНК - например, тиротрицин;

- аминогликозидные   антибиотики - бутирозин.

В последние годы было достоверно установлено, что B.subtilis продуцирует такие антибиотики, как атерримин, aspergillus-фактор, бацилипин, бацилизин, бацилломиксин, бациллин, бульбифор-мин, глобицин, датемицин, дебариоцидин, истеидин, итурин, ксантелин, микосубтилин, микобаииллин, неоцидин, обутин, петрин, полихлоросубтилин, ризобацидин, ризостониа-фактор, субтилин, субтенолин, субтенолизин, субтилизин, субспорин, токсимицин, трипанотоксин, фунгистатин, фунгоцин, флювомицин, эндосубтилизин, эумицин, антибиотики 49-4, 6633, 26а, В-456, 3, бацилломицин.

Атерримин образуется темнопигментным штаммом В.subtilis v.aterrimus. В 1957 г. из культуры выделены два анти­биотических вещества, близкие по природе — атерримины А и В, ко­торые представляют собой лактоны. Атерримины А и В характеризуются выраженным антибиотическим действием на грамположительные бактерии.

Aspergillus-фактор - антибиотическое вещество, которое получил в 1949 г. Michener М. из культуры В.subtilis 6633. Природа антибиотика не изучена. В небольших концентрациях оказывает выраженное дей­ствие на различные виды грибов и дрожжей.

Субтилин был выделен из культурального фильтрата штамма В.subtilis 6633. Этот антибиотик подавляет рост ряда микроорганизмов: R.nigricans - в дозе 8,1 мкг/мл; R.solani - 0,4; S.bataticola - 3,5; S.fructicola - 5,9; P.digitatum - 6,2; A.niger - 9,9; B.cinerea - 4,8 мкг/мг.

Бацилипины А и В описаны в 1949 г. Эти антибиотики получены из культуры В.subtilis. Бацилипины А и В оказывают выраженное бактериостатическое действие на M.phlei, S.aureus, C.diphteriae, В.anthracis, S.enteritidis, S.typhi, E.coli.

Бацилизин - антибиотик, который так же, как и бацилипины А и В, получен в 1949 г. из культуры В.subtilis. Антибиотик представляет собой пептид, содержащий аминокислоты: аланин, тирозин, лейцин, фенилаланин, серусодержащую аминокислоту. Оказывает бактерицидное действие на M.phlei, S.aureus, C.xerose, E.coli.

Бацилломиксин - антибиотический комплекс, опи­санный в 1951 г., представляет собой полипептид, в составе которого имеются глютаминовая и аспарагиновая аминокислоты, тирозин, серии и треонин.

Бацилломицин - антибиотик, полученный в 1947 г., характеризуется высокой избирательной активностью против па­тогенных грибов и дрожжей. В дозах 0,025 мкг/мл подавляет рост М.andonini, M.gypseum, T.rubrum, T.schonleini, E.floccosum, B.brasiliens, C.immitis, H.capsulatum, M.apiospormum.

Бациллин - антибиотик, полученный из культуры В.subtilis в 1946 г. Подавляет рост грамположительных микроорганизмов (S.aureus, S.albus, S.pyogenes, S.lanceolatus) и грамотрицательных (Е.coli, S.parathyphi, Pasterella sp.). Вве­дение бациллина мышам внутрибрюшинно в дозе до 1000 мг/кг не вызы­вает патологических изменений.

Бульбиформин выделен в 1952 г. в виде концентрата. Подавляет рост грибов, не активен в от­ношении бактерий. Природа этого антибиотика не изучена.

Глобицин получен из культуры В.subtilis в 1952 г. В дозе 10 мкг/мл подавляет рост S.aureus, В.cereus, M.phlei, M.avium.

Датемицин - антибиотик, полученный в 1955 г., оказывает угнетающее действие на рост различных грибов в дозах 50-100 мкг/мл.

Дебариоцидин выделен в 1958 г. Задерживает рост некоторых видов дрожжеподобных грибов.

Истеидин - антибиотик, выделенный в 1959 г. Подавляет рост грибов и дрожжей.

Итурин синтезируется культурой В.subtilis v.ituriensis. Выделен в 1950 г. Антибио­тик подавляет рост Е.coli, S.marcescens, S.aureus, Corynebacterium. Более выраженное действие итурин оказывает на грибы, в том чис­ле, на патогенные для человека и животных.

Ксантелин получен в 1951 г. Подавля­ет рост грамположительных, грамотрицательных, кислотоустойчивых бактерий. Оказывает угнетающее действие на возбудителей бруцеллеза.

Микосубтилин — антибиотик, синтезируемый куль­турами В.subtilis, которые продуцируют также субтилин. Микосубтилин высокоактивен в отношении ряда грибов и дрожжей. В дозе 1,5 мкг/мл подавляет рост Trichophyton sp. и U.zeae, в дозе 2,5 мкг/мл - S.fructicola, в дозе 3,75 мкг/мл оказывает угнетающее действие на T.delbruckii, Hansenulaanomala, в дозе 5,0 мкг/мл - нa T.cremoris, S.rosens, C.neoformans, M.audouini, R.rubra, A.schonleini.

Микобациллин выделен и описан в 1958. В дозах 0,02 мкг/мл подавляет рост A.niger, C.albicans. Успешно применяется при лечении грибковых поражений кожи. Подавляет также рост грибов - возбудителей некоторых болезней растений.

Неоцидин — антибиотический концентрат, выделенный из культуры В.subtilis в 1951 г. Характеризуется бактериологическим действием на грамположительные бактерии М.tuberculosis avium.

Обутин получен в 1951 г. И проявляет антибактериаль­ную активность я в отношении S.aureus, В.anthracis. По антибиотическим свойствам сходен с неоцидином.

Петрин — антибиотик, полученный в 1958 г. В дозах 6,7-40 мкг/мл подавляет рост N.meningi­tis, H.pertussis, H.parapertussis, H.ihfluenzae, N.gonorrhoeae, C.diphteriae.

Полихлорсубтилин описан в 1965 г. Действует преимущественно на грамотрицательные микроорганиз­мы.

Ризобацидин выделен в 1952 г. в кристаллическом виде. Пред­ставляет собой пептид, оказывающий антибиотическое действие на возбудителей заболеваний растений.

Ризостониа-фактор получен из культуры В.sub­tilis 6633. Описан в 1949 г. Характеризуется избира­тельной активностью в отношении ряда микроскопических грибов и дрожжей. Получен из водного раствора культуры, которая использу­ется для производства субтилина. Ризостониа-фактор обладает антифунгальными свойствами. Угнетает рост Rothium sp. в дозе 270 мкг/мл, R.nigricans - 160, R.solani - 45, S.bataticola - 64, S.fructicola - 14, P.digitatum - 68, B.cinerea - 6,4 мкг/мл.

Субтилин продуцируется культурой В.subtilis NRRL-B 545. Характеризуется выраженным бактерицидным действием на многие, в том числе патогенные, микроорганизмы. Высокоактивен, в частности, против T.pallidum, S.aureus, В.anthracis, В.cereus, Neisseria, M.tuberculosis. Успешно применяется в пищевой промышленности как консервант, особенно в производстве консервов из скоропортящихся продуктов. Прибавление небольших доз этого антибиотика позволяет значительно уменьшить время стерилизации, что обеспечивает сохранение естест­венного цвета консервируемых продуктов, особенно фруктов.

Субтенолин выделен в 1948 г. Подавляет рост некоторых грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: в дозе 16,5-22,5 мкг/мл - Pasteureulla sp.; в дозе 140-200 мкг/мл - S.aureus; 165 мкг/мл - S.typhi.

Субтилизин описан в 1945. Обладает ферментными свойствами: лизирует Е. coli, C.septicum, C.oedematiens, S.enteritidis, Pasteurella sp. в дозах 20 - 50 мкг/мл. Полученный из этой же культуры препарат анализин по своим свойствам аналогичен субтилизину.

Субспорин — комплекс антибиотических веществ, обра­зуемых штаммом В.subtilis PCI-219. Известны субспорины А, В и С. Активность субспорина А не снижается после воздействия хемо-трипсина, пепсина или карбоксипептидазы. Проявляет высокую анти­биотическую активность по отношению к некоторым видам грибов и дрожжей.

Токсимицин получен в 1952 г. в виде концент­рата. Прояв­ляет антибиотические свойства в отношении фитопатогенных грибов и В.cereus. Обладает также антивирусными свойствами.

Трипанотоксин, выделенный  в 1911 г., подавляет рост Spirillum и Leishmania.

Фунгистатин (синоним - антибиотик XG) описан в 1946 г. Характеризуется выраженным антибиотическим действием в отноше­нии некоторых грибов, патогенных для человека, животных и расте­ний. В дозах 4-10 мкг/мл подавляет рост T.gypseum, E.floccosum, Rhodotorula, M.alpicans.

Фунгоцин описан в 1952 г. По антибиоти­ческим свойствам сходен с фунгистатином и бацилломицином. Обладает противогрибной активностью. Антибиотик не диализируется, адсор­бируется на активированном угле. Не инактивируется пепсином или трипсином. Не растворяется в воде, эфире, хлороформе. Молекулярная масса 1100Д.

Флювомицин (синонимы: Efsiomycin, Vivicil, Riomycin) — антибиотик, образуемый культурой В.subtilis FC-5036. Выделен в 1952 г. Наиболее выраженное действие оказывает на S.aureus, P.vulgaris, E.coli и C.albicans.

Эндосубтилизин — антибиотик, описанный в 1946 г. В дозах 1 мкг/мл подавляет рост S.aureus, в боль­ших дозах - S.haemolyticus и M.tuberculosis.

Эумицин открыт в 1946 г. Оказывает наиболее выраженное антибио­тическое действие в дозе 5 мкг/мл на C.diphteria.

Среди бактерий вида В.subtilis описаны продуценты нескольких антибиотиков, которым еще не присвоены названия. Это такие, как антибиотик 26а, антибиотик TL-119, антибиотик В-456, антибиотик 49-4, антибиотик 61-26 и антибиотик, продуцируемый штаммом В.subtilis 3.

В 1978 г. Jarosz J.  опубликовал данные о поли­пептидном антибиотике, полученном из культуры В.subtilis 26a. Продуцент антибиотика - В.subtilis 26a – был изолирован из кишеч­ника личинки большой восковой моли. Указанный штамм продуцирует несколько биологически активных веществ, находящихся в смеси: это полипептидный антибиотик типа бацитрацина, бактериальный фермент, характеризующийся эндо-β-N-ацетилмура-мидгликаногидролазной активностью и неидентифицированное активное вещество. Антибиотик образуется преимущественно в стационарной фазе раз­вития культуры — в то время, когда происходит споруляция. В составе препарата обнаружено 12 остатков аминокислот, в их числе глютаминовая, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, орнитин и цистин.

Антибиотик 26а не инактивируется сывороткой крови; не снижает активности под влиянием пепсина, трипсина, липазы. Максимальную антибиотическую активность проявляет в отношении микрококков и бацилл в дозах 0,078—0,3 мкг/мл. По спектру антимикробного дейст­вия антибиотик близок к пенициллину, бацитрацину и лизоциму.

В 1975 г. был выделен антибиотик TL-119, синтезиру­емый культурой В.subtilis TL-119, изолированной из почвы Таиланда. Молекулярная масса антибиотика TL-119 - 800Д; он отнесен к полипептидам. В составе антибио­тика определены следующие аминокислоты: фенилаланин, треонин, аланин, валин и лейцин.

Об антибиотике В-456, образуемом В.subti­lis, сообщил в 1956 г. Tanaka. Этот антибиотик представляет собой препарат полипептидной природы и содержит d-тирозин. Обладает про­тивогрибным действием.

Антибиотик 49-4 продуцируется культурой В.subtilis DINR-49-4. Описан в 1964 г. Получены три полипептидные фракции. Аминокислотный состав всех трех фракций оказался сходным: аспарагиновая и глютаминовая кислоты, пролин, серии, тирозин. Биологическая активность фракций различалась. Первая  наиболее активна в отношении Neurospora crassa; вторая - Penicillium chrysogenum, третья - Trichophyton tonsurans. Все три выделенные антибиотические вещества - полипеп­тиды и отнесены к группе бацилломицина. Различаются по содержанию в них пролина.

Антибиотик 61-26 образуется культурой В. subtilis 61-26, изолированной из почв Новой Гвинеи. Описан в 1975 г. Анализ ИК-спектров показал, что антибиотик 61-26 является пептидом, содержащим лактон или эфирную связь (предположительные данные). Молекулярная масса около 1200Д. Содержит следую­щие аминокислоты: аспарагиновую, серии, валин и изолейцин. Препарат 61-26 оказывает антибиотическое действие на грамполо-жительные бактерии, некоторые грибы и дрожжи, в том числе патоген­ные для человека и животных.

В 1979 г. Харченко С.Н. и соавт. описали способ борьбы с плесневением кормов при использовании штам­ма В.subtilis 3. Этот штамм продуцирует антибиотик, подавляющий рост некоторых грибов (Stachybotris alternans Bonord и Dendrodochium toxicum), а также патогенных и условно патогенных бактерий: Е.coli, P.vulgaris, Ps. aeruginosa, В.anthracis, C. albicans. Согласно предварительным данным о хими­ческой природе антибиотика, это - низкомолекулярный полипептид, в составе которого обнаружены фенилаланин, гистидин, аспарагиновая кислота. Антибиотик растворим в воде, его водные растворы стойкие.

Штамм В.subtilis 3 используется в сельском хозяйстве для борь­бы с плесневением кормов, вызываемым такими грибами, как Stachy­botris alternans и Dendrodochium toxicum. Обработка кормов (солома, сено) осуществляется аэрозольным способом с использованием суспен­зии культуры в разведении 500 млрд. клеток на 10 л воды.

Микологическими исследованиями установлено, что при обработке культурой, например, соломы, пораженной Stachybotris alternans, количество высеваемых из обработанного субстрата колоний гриба сни­жается в зависимости от продолжительности и контакта микромицета с антагонистом: через две недели - в 6 раз, через месяц - в 23-25 раз. Кроме того, у животных отмечается снижение заболеваемости желудочно-кишечными болезнями.

Таким образом, можно констатировать, что бациллы, и в первую очередь, B.subtilis, характеризуются  широким спектром продуцируемых ими антибиотических веществ, обуславливающих их высокую антагонистическую активность в отношении различных микроорганизмов. Поэтому, создание препаратов на основе бацилл или их метаболитов, является принципиально новым подходом к лечению бактериальных, вирусных, грибных и смешанных инфекций.

Биосинтез бактериями рода Bacillus ферментов, аминокислот и других биологически активных веществ

 По данным отечественных и зарубежных ученых бактерии рода Bacillus характеризуются полиферментативными свойствами. Клетки бацилл включают набор ферментов раз­личных классов, что обеспечивает им возможность существовать в разно­образных субстратах.

 

Ферменты, обнаруженные у представителей рода Bacillus (Таблица 2)

Класс	Тривиальное название
Оксидоредуктазы	l–Лактатдегидрогеназа
	Нитратредуктаза
Трансферазы	Пируваткиназа
	Левансахараза
	Рибонуклеаза
Гидролазы	Аминопептидаза
	Субтилопептидаза
	Плазмин
	Ксиланаза
	Фосфодиэстераза
	а-Амилаза
	а-Амилаза К (а-1,4-глюкан-4-глюкано-гидролаза)
	Дезоксирибонуклеаза
	Аргиназа
	β-Ацетилглюкозаминидаза
Гидролазы	Фосфотаза фосфорилазы
	Мальтаза (α-глюкозидаза)
	Эстераза, сходная с карбоксилэстеразой
	Ламинариназа
Лиазы	Треониндегидратаза
	Пектатлиаза
	Аконитатгидратаза (аконитаза)
	Кетозо-1-фосфатальдолаза (альдолаза)

У бацилл особенно хорошо развита система гидролаз - ферментов, катализирующих реакции гидролитического расщепления молекул. Среди гидролаз практический интерес представляют протеолитические ферменты, составляющие особый подкласс пептид-гидролаз.

Основной функцией протеолитических ферментов является расщеп­ление белков, содержащихся в окружающей среде, и превращение их в форму, способную легко проникать внутрь клетки. В связи с этим большинство известных протеаз функционируют как экстрацеллюлярные ферменты. Большинство пептидаз являются внутриклеточными фер­ментами.

Внеклеточные протеазы, кроме основных функций - катализа гид­ролиза экзогенных белковых субстратов, принимают участие в разло­жении вегетативного клеточного материала для последующего исполь­зования в анаболических и катаболических реакциях. Протеазы В.subtilis играют большую роль в разрушении белковых оболочек спор во время их прорастания.

Инициация споруляции обусловлена расщеплением внекле­точной сериновой протеазой β-субъединицы РНК-полимеразы, что приводит к изменению ее матричной специфичности и превращению в РНК-полимеразу спорулирующих клеток.

Имеются данные о том, что протеазы снимают действие белковых ингибиторов споруляции. Анализ аспорогенных мутантов у представителей рода Bacillus показал, что многие из них не образуют внеклеточной протеазы и что реверсия к спорообразованию сопровождается способностью продуцировать протеазу. Высказывается предпо­ложение об участии внеклеточных протеаз в синтезе полипептидных антибиотиков.

Наиболее активными продуцентами внеклеточных протеаз являются  В.subtilis и В.mesentericus.

Среди 990 штаммов рода Bacillus, исследованных Maceda-Coronels и соавт. (1974), 860 расщепляли казеин на казеиновом агаре. У бацилл широко распро­странено свойство синтезировать фибринолитические ферменты.

У В.subtilis и В.mesenteri­cus обнаружена способность растворять экспериментально вызванные у лабораторных животных тромбы кровеносных сосудов, а также гидролизовать фибриллярный белок эластин. Протеазы этих бактерий превращают фибрин в растворимую форму путем расщепления аргинил-глициновых свя­зей фибрина.

Из клеток бацилл выделены и изучены внутриклеточные протеазы. Они появляются на ранних этапах споруляции, раньше, чем протеа­зы в культуральной жидкости. Установлена тесная взаимосвязь между внутриклеточными и внеклеточными протеазами спорулирующих бактерий. Внутриклеточные протеазы способны инициировать оборот белка и принимать участие в споруляционно-специфической пост­трансляционной модификации белков.

С помощью афинной хроматографии выделены в гомогенном виде внутриклеточные протеазы из В.subtilis и В.licheniformis, уста­новлена их гомологичность, что подтверждает родство этих двух видов.

Известны протеазы бацилл преимущественно двух типов — сериновые и металлопротеазы. Так, из В.subtilis выделены две гомогенные сериновые протеазы, отличающиеся молекулярной массой: I – 23000-24000 Д, II - 29000 Д; и смесь протеаз с молекулярной массой 26000 Д. В.subtilis может синтезировать одновременно металлопротеазы и сериновые протеазы.

Протеазы бактерий рода Bacillus делятся на щелочные и нейтраль­ные по рН-оптимуму их действия. Значительно реже у них обнаружи­ваются кислые протеазы. Наиболее известны и хорошо изучены щелоч­ные протеазы — субтилизин А (субтилопептидаза А), субтилизин В (Novo), субтилизин BPN, выделенные из различных штаммов В. subtilis.

Из В.subtilis получена щелочная протеиназа с оптиму­мом действия при рН 10,5-11,0 и температуре 55°С, устойчивая к ПАВ.

В.subtilis продуцирует и нейтральные протеазы. Оптимум их действия проявляется в диапазоне рН около 7,0. Общим признаком этих ферментов является наличие ионов металлов в активном центре и действие ингибиторов типа ЭДТА.

Бациллы образуют обычно комплекс ферментов с близкими физико-химическими и каталитическими свойствами. Препараты щелочных протеаз из В.subtilis и В.licheniformis гетерогенны и состоят из нескольких ком­понентов. По скорости движения на электрофореграммах протеолитические компоненты препаратов разделены на шесть типов, три из кото­рых отнесены к субтилизинам.

Протеолитические ферменты привлекают большое внимание не только ввиду их распространенности и большого значения для жизни клетки, но и в связи с перспективами их применения в народном хозяй­стве, медицине и ветеринарии.

Протеолитические ферменты использу­ют в парфюмерии и косметике; в микробиологической промышленности для приготовле­ния питательных сред; в биохимии для теоретических исследований и др. 

Протеазы внедряются в ветери­нарную практику и медицину для лечения воспалительных процессов, для очистки гнойных и некротических ран, ожогов, обмораживаний, для растворения тромбов и лечения некоторых опухолей. Разработаны промышленные способы получения субтилизинов, протосубтилизинов, мезентеринов, амилосубтилина.

Среди других ферментов бацилл большой интерес представляют внутриклеточные литические ферменты.

В.subtilis – это первый мик­роорганизм, у которого была обнаружена способность лизировать не только собственные клетки, но и клетки других бактерий и грибов.

Литические ферменты бацилл представляют собой сложный комп­лекс, состоящий из ферментов с различной субстратной специфич­ностью. Они делятся на две группы: ферменты, участвующие в лизисе клеточных стенок бактерий, и ферменты, лизирующие клеточные стен­ки дрожжей и микроскопических грибов.

Бактериолитические ферменты некоторых аэробных спорообразующих бактерий проявляют высокую активность в отношении клеточных стенок M.lysodeikticus, В.megaterium, S.aureus, P.aeruginosa, E.coli, S.typhimurium.

Литические ферменты бацилл применяются в микробиологической промышленности для производства амилосубтилина, в животноводстве - для улучшения качества кормового белка, в медицине - в качестве анти­микробных агентов, а также - в теоретических ис­следованиях для расшифровки структуры клеточных стенок микроор­ганизмов.

Бактерии рода Bacillus вырабатывают α- и β-амилазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы, которые можно использовать для получения глю­козы, мальтозы, глюкозо-фруктозных паток. Из этих ферментов широкое промышленное применение нашла амилаза, кото­рая используется в пищевой промышленности.

Фермент α-амилаза гидролизует α-1,4-глюконовые связи в полисахаридах и обладает активной разжижающей способностью. Этот фермент образуется культурами В.subtilis и В.amyloliqulfaciens.

Фермент β-амилаза является осахаривающим ферментом, гидролизующим крахмал с образованием мальтозы.

Практическое применение находят пектиназа - для мочки лубоволокнистых растений; пенициллиназа (β-лактамаза) - в медицине и фармацевтической промышленности.

Иммобилизация некоторых ферментов бацилл позволила во много раз увеличить срок хранения ферментов и перейти к непрерывным техно­логическим процессам. Например, в производстве пива используют иммобилизованную протеазу В.subtilis в качестве стабилизатора против белкового помутнения.

Оказалось возможным иммобилизовать не только  ферменты, но и живые клетки, которые в этом состоянии способны осу­ществлять ферментативные реакции в течение длительного времени. Так, разработан способ включения клеток В.subtilis в 5%-ный акриламидный гель с сохранением иммобилизованными клетками актив­ности α-амилазы.

Благодаря высокой биохимической активности, многообразию мета­болических путей аэробные спорообразующие бактерии участвуют в биологическом разрушении чужеродных токсических соединений и мо­гут быть использованы для борьбы с загрязнением окружающей среды.

Аэробные спорообразующие бактерии обладают способностью к повышенной экскреции свободных аминокислот в культуральную среду и могут служить источником их получения в крупномасштаб­ном производстве.

Среди выделяемых бацилл большинство штаммов (до 43%) образу­ют лизин, 21,5% штаммов — фенилаланин,  7% штаммов образуют цистин, метионин, гистидин; 3,5% штаммов — триптофан.

По данным Romero и соавт. (1978), из 38 исследованных штаммов рода Bacillus,  31 образовывал аргинин, 30 - лизин, 26 - лейцин, 26 - аспарагин.

Валин в наибольших количествах накапливается в куль­турах В.subtilis. Концентрация валина в культуральной жидкости при выращивании В.subtilis на глюкозно-солевой среде достигает 4,8 г/л.

Аминокислоты, продуцируемые бациллами, обладают золоторастворяющими свойствами, что имеет большое практическое значение для получения этого ценного металла в трудных для гидрометаллургии условиях.

Аэробные спорообразующие бактерии изучаются как возможные продуценты белка. Установлено, что белковая масса бацилл содержит все незаменимые аминокислоты, за исключением серосодержащих. Выход биомассы при выращивании в ферментере с добавками мелассы составляет 15-20 г сухого вещества на 1 л питательной среды. Биомасса при этом содержит 8-9% азота, 40% белка, до 30% поли-β-оксимасляной кислоты и 10-14% РНК.

У бацилл обнаружена способность образовывать внеклеточный бе­лок.

Бактерии рода Bacillus с 1959-60 гг. известны как продуценты пуриновых нуклеотидов, широко используемых в пищевой промышлен­ности в качестве приправ, а также в медицине для лечения некоторых вирусных инфекций, тромбозов и др.

Селекционированы штаммы В.subtilis, продуцирующие в глюкозной среде при 30-32°С в течение 60-72 ч инозита - до 11,65 г/л, гипоксантина - до 2,05 г/л, гуанозина - до 15-16 г/л. Эти штаммы используются для получения нуклеотидов путем управля­емой ферментации, в том числе многоступенчатой, а также посредством разрушения выделяемых нуклеиновых кислот.

Бациллы могут быть источником получения ингибиторов некоторых ферментов и антагонистов витаминов. Из культуральной жидкости В.amyloliquifaciens, В.polymyxa, В.subtilis, В.subtilis v.niger выделены ингибиторы глюкозидаз. Активными антагонистами витамина В₁₂ у бацилл, в частности у В. cereus, являются пептиды.

Бациллы синтезируют витамины и выделяют их в среду. Многие штаммы, изолированные из ризосферы, продуцируют витамин В₁₂ - до 50-60 мкг/мл. Этот витамин получают в ряде стран промышленным путем из отселекционированных штаммов бацилл.

Ростостимулирующая активность некоторых штаммов бацилл объясняется продуцированием комплекса витаминов - тиа­мина, пиридоксина, пантотеновой кислоты, инозита, никотиновой кислоты.

Получены мутанты В.subtilis, синтезирующие витамин В₆ (2-5 мг/л), рибофлавин и др.

Приведенные данные свидетельствуют о высокой биологической активности  В.subtilis, широком спектре синтезируемых веществ, имеющих огромное значение для современной биотехнологии и ветеринарии.

 

* При копировании статьи обязательно ссылаться на сайт www.probiotic-olin.ru